确定样本中柔膜菌纲细菌的确定预定的核酸序列存在的等温实时pcr方法
1.本发明涉及一种用于确定样本中预定的核酸序列的存在的方法，所述方法包括以下步骤：向待分析是样本预定否存在预定的核酸序列的样本中添加一种或多种提供rna-依赖性和/或dna-依赖性dna聚合酶活性与链置换活性的活性的酶；向待分析是否存在预定的核酸序列的样本中添加至少五种dna引物，其中，中柔至少一种dna引物包含与核酸序列可杂交的膜菌序列并且至少一种dna引物包含与与该核酸序列反向互补的dna序列可杂交的序列；在固定温度孵育得到的样本；确定样本中是否存在双链延长的dna序列，其中，纲细样本中双链延长的酸序时dna序列的存在表示样本中预定的核酸序列的存在，其中，列存流程预定的温实核酸序列为柔膜菌纲(mollicutes c1ass)的细菌的序列，并且其中未使用f3引物。确定
2.研究实验室中的样本预定细胞系和原代细胞以及生物技术或制药行业中使用或制造的细胞来源的产品受到柔膜菌(mollicutes)的污染是一个主要问题。柔膜菌是中柔各种动物(包括人类)和植物的细菌。它们存活在宿主细胞内或宿主细胞上，膜菌并且许多是纲细致病的。由于它们的酸序时数量大，细胞或组织培养物以及在处理细胞/组织的列存流程行业中使用的和制造的其它产品很容易受到污染。这些被污染的材料必须被净化或销毁，从而导致额外的成本和负担。可以越早检测到污染，控制污染(即净化材料)就越容易、成本更低、速度更快。
3.根据以上内容，需要可靠的、有成本效益的且快速的方法用于确定柔膜菌纲的细菌的存在。
4.上述技术问题由本文所提供的实施方案解决并且如权利要求中所表征。
5.因此，本发明尤其涉及以下实施方案。
6.1.一种用于确定样本中预定的核酸序列的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
7.(a)向待分析是否存在预定的核酸序列的样本中添加一种或多种提供rna-和/或dna-依赖性dna聚合酶活性与链置换活性的活性的酶；
8.(b)向待分析是否存在预定的核酸序列的所述样本中添加至少五种dna引物，其中，至少一种dna引物包含与所述核酸序列可杂交的序列并且至少一种dna引物包含与与所述核酸序列反向互补的dna序列可杂交的序列；
9.(c)在固定温度孵育步骤(a)和(b)得到的所述样本；
10.(d)确定所述样本中是否存在双链延长的dna序列，
11.其中，所述样本中所述双链延长的dna序列的存在表示所述样本中所述预定的核酸序列的存在，
12.其中，所述预定的核酸序列为柔膜菌纲的细菌的序列，并且其中未使用f3引物。
13.2.根据实施方案1所述的方法，其中，所述至少五种引物分别包括正向内引物(forward inner primer，fip)、反向内引物(backward inner primer，bip)、正向环引物(loop primer forward，lpf)和反向环引物(loop primer backward，lpb)。
14.3.根据实施方案1或2所述的方法，其中，所述至少五种引物还包括b3引物。
15.4.根据实施方案1至3中任一项所述的方法，其中，所述预定的核酸序列为rna序列或dna序列。
16.5.根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其中，所述柔膜菌纲的细菌属于支原体属(mycoplasma)、螺原体属(spiroplasma)、无胆甾原体属(acholeplasma)或脲原体属(ureaplasma)。
17.6.根据实施方案5所述的方法，其中，所述细菌为口腔支原体(m.orale)、精氨酸支原体(m.arginini)、发酵支原体(m.fermentans)、猪鼻支原体(m.hyorhinis)、莱氏衣原体(a.laidlawii)、人型支原体(m.hominis)、滑液支原体(m.synoviae)、柑橘僵化螺原体(s.citri)、肺炎支原体(m.pneumoniae)、牛支原体(m.bovis)、唾液支原体(m.salivarium)或鸡毒支原体(m.gallisepticum)。
18.7.根据实施方案4至6中任一项所述的方法，其中，所述rna包含在16s rrna或23s rrna中。
19.8.根据实施方案4至6中任一项所述的方法，其中，所述dna为编码16s rrna的基因或编码23s rrna的基因。
20.9.根据实施方案1至8中任一项所述的方法，其中，所述样本从原代或修饰的细胞和/或组织、细胞培养物、培养基和/或添加剂、细胞来源的产物、实验室设备或生物制药产品，如前沿疗法药物(advanced therapy medicinal product，atmp)获得。
21.10.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中，所述固定温度在50℃和75℃之间。
22.11.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中，将步骤(c)中的所述样本孵育1分钟至120分钟。
23.12.根据实施方案1至11中任一项所述的方法，其中，通过使用与所述双链延长的dna序列可杂交的核酸分子，特别地其中所述核酸分子被标记；使用嵌入所述双链延长的dna序列的分子或使用浊度测量来确定所述样本中所述双链延长的dna序列的存在。
24.13.一种净化被柔膜菌纲的细菌污染的细胞和/或组织培养物的方法，所述方法包括：向所述培养物施用有效量的抗生素，其中，通过使用根据实施方案1至12中任一项所述的方法，所述培养物先前已被确定为被所述柔膜菌纲的细菌感染。
25.14.根据实施方案13所述的方法，其中，所述抗生素药物为bm cyclin。
26.因此，在第一方面，本发明涉及一种用于确定样本中预定的核酸序列的存在的方法，所述方法包括以下步骤：向待分析是否存在预定的核酸序列的样本中添加一种或多种提供rna-和/或dna-依赖性dna聚合酶活性与链置换活性的活性的酶；向待分析是否存在预定的核酸序列的样本中添加至少五种dna引物，其中，至少一种dna引物包含与核酸序列可杂交的序列并且至少一种dna引物包含与与该核酸序列反向互补的dna序列可杂交的序列；在固定温度孵育得到的样本；确定样本中是否存在双链延长的dna序列，其中，样本中双链延长的dna序列的存在表示样本中预定的核酸序列的存在，其中，预定的核酸序列为柔膜菌纲的细菌的序列。
27.如本文所使用的术语“预定的核酸序列”是指核酸序列，优选rna序列或dna序列，其中，本领域技术人员知晓它是柔膜菌纲的细菌的一部分。特别地，本发明中预定的核酸序列为使用本发明的方法可检测的序列。换言之，如果本领域技术人员能够使用本文所提供的方法确定序列是否可能在样本中被检测到，那么本领域技术人员可获得的核酸序列是预定的。在本发明中，该预定的核酸序列包含至少一个引物结合位点，该至少一个引物结合位
点与本发明的方法中使用的至少一种引物至少部分相同。如果序列完全相同或如果它们的不同之处仅在于一个序列包含尿嘧啶而非胸腺嘧啶和/或如果它们的不同之处仅在于一个序列包含一个或多个修饰的核苷酸而非各自的非修饰的核苷酸，那么引物结合位点被认为与引物位点相同。柔膜菌纲的细菌的预定的核酸序列可以来自该细菌的任何部分。在一些实施方案中，柔膜菌纲的细菌的预定的核酸序列是一种序列，其中，本领域技术人员知晓它是选自细胞核、核糖体、线粒体、细胞质和质粒的组的细菌的至少一部分的一部分。
28.如本文所使用的术语“样本”是指可能包含柔膜菌纲的细菌的预定的核酸序列的任何样品。用于本发明的方法的样本可以来源于原代或修饰的细胞、组织、细胞培养物、培养基、添加剂、细胞来源的产物、实验室设备、生物制药产品(如atmp)、血液、活体(例如，植物和/或动物)、微生物和/或，例如从食物、土壤和/或废水中分离的样本。可以通过本领域技术人员已知的任何方法实施从初始样本中分离核酸，例如，使用表面活性剂的裂解处理、声波处理、使用玻璃珠的摇动搅拌或法式滤压方法(french press method)。在本发明的方法中，内源性核酸酶可以用于减少核酸分子的长度。在本发明的方法中，核酸的纯化可以通过例如苯酚萃取、色谱法、离子交换、凝胶电泳、密度依赖性离心和/或本领域技术人员已知的其它方法实施。
29.如本文所使用的术语“dna引物”或“引物”是指包含3’端-羟基的核酸分子，其在与互补核酸序列杂交时，可以例如通过酶催化的核酸复制反应伸长。根据本发明的引物对用于核酸的扩增，即用于lamp分析或rt-lamp分析。引物的长度的上限和下限均根据经验确定。本文所描述的引物可以是正向引物或反向引物。如本文所使用的术语“反向引物”是指一种引物，其引发dna序列的反义链以使得聚合酶沿dna序列的互补链在一个方向上延伸。至少一条反向引物也可作为用于逆转录的rt引物。如本文所使用的术语“正向引物”是指一种引物，其引发dna序列的有义链以使得聚合酶沿dna序列的一条链在一个方向上延伸。
30.一种提供rna-和/或dna-依赖性dna聚合酶活性的活性的酶可以基于由dna链或rna链组成的模板以5
′→3′
方向合成dna。如本领域技术人员所知晓的，这种酶将连续向模板的游离3
′‑
羟基添加核苷酸。在这方面，模板链基于watson-crick碱基配对确定添加的核苷酸的序列。dna聚合酶的活性可以是rna-和/或dna-依赖性的。示例性的聚合酶包括但不限于bst dna聚合酶、vent dna聚合酶、vent(外部-)dna聚合酶、deep vent dna聚合酶、deep vent(外部-)dna聚合酶、bca(外部-)dna聚合酶、dna聚合酶i klenow片段、φ29噬菌体dna聚合酶、z-taq
tm dna聚合酶、嗜热性(thermophi)聚合酶、9
°
nm dna聚合酶和kod dna聚合酶。例如，参见u.s.专利号5,814,506、5,210,036、5,500,363、5,352,778和5,834,285；nishioka,m.,et al.(2001)j.biotechnol.88,141；takagi,m.,et al.(1997)appl.environ.microbiol.63,4504。
31.作为提供rna-依赖性dna聚合酶活性的活性的酶，可以采用任何合适的逆转录酶。在这方面，待使用的酶没有被特别限制，条件是它具有使用rna作为模板以合成cdna的活性。此外，可以添加提高核酸扩增酶的耐热性的物质，如海藻糖。
32.当在本说明书中简单地表述为“5'-端侧”或“3'-端侧”时，其表示在所有情况下都被视为模板的链中的方向。此外，当描述3'-端侧成为互补链合成的起点时，其表示3'-端侧-羟基为互补链合成的起点。
33.如本文所使用的术语“链置换”是指在引物引发的合成过程中，酶分离双链的dna
分子和/或双链的rna分子中的dna链和/或rna链的能力。
34.如本文所使用的术语“杂交”是指互补的核酸分子的退火。当两个核酸彼此“杂交”时，或者当一个核酸与另一个核酸“杂交”时，这两个核酸分子表现出足够数量的互补核碱基，使得这两个核酸分子可以在用于特定的反应的特定条件(例如，温度、盐和其它缓冲条件)下彼此退火。最常见的杂交的机制涉及核酸分子的互补核碱基之间的氢键合(例如，watson-crick、hoogsteen或反向hoogsteen氢键合)。杂交可以在不同条件下发生。严格条件是序列依赖性的并且由待杂交的核酸分子的性质和组成确定。核酸杂交技术和条件是本领域技术人员已知的并且已经被广泛描述。例如参见sambrook et al,molecular cloning:a laboratory manual 2nd ed.；cold spring harbor press,1989；ausubel et al,1987,current protocols in molecular biology；greene publishing and wiley-interscience,new york；tijessen,1993,hybridization with nucleic acid probes,elsevier science publishers,b.v.；以及kricka,1992,non-isotopic dna probe techniques,academic press,san diego,california。
35.如本文所使用的术语“f3”是指引物对的外部正向引物。
36.虽然以前的lamp方法假定f3引物在扩增过程(例如参见nagamine et al.2002.molecular and cellular probes 16.223-229)中是释放cdna链所必需的，发明人发现，省略f3引物不会损害扩增过程。
37.在本发明中，令人意外地发现其中省略了f3引物的五引物系统在检测预定的核酸序列中是最有效的。如本文所使用的“最有效的”是指检测与通常使用的技术一样快速和灵敏，但保持了可靠性，这是用于检测核酸(如来源于柔膜菌的核酸)的测试的先决条件。此外，发现通过使用五种引物代替标准lamp技术中的六种引物，可以检测到较短的靶序列。
38.本发明提供了一种含有预定的核酸序列的样本，以及一种用于扩增核酸的方法，其包括：在其中存在至少一种本发明的引物的反应系统中实施样本中的预定的核酸序列的扩增反应。在本发明的一些实施方案中，至少一类(species)引物用于本发明的核酸扩增反应。换言之，本文所描述的dna引物可以与其它引物组合使用，或可以使用两类本文所描述的dna引物。
39.在本发明的方法中优选的是，使用五种dna引物。在一些实施方案中，本发明中采用的至少两种引物是环引物。如本文所使用的术语“环引物”是指一种dna引物，其包含与预定的rna序列的扩增产物的至少一个环区可杂交的序列。该环区是通过扩增产物链退火至自身形成的。通常，环引物与生成的dna序列杂交，并且为进一步dna延伸过程的启动提供增加的数量的起点。环引物的使用可以加速扩增过程。
40.在本发明中优选的是，至少五种引物分别包括正向内引物(fip)、反向内引物(bip)、正向环引物(lpf)和反向环引物(lpb)。
41.如本文所使用的术语“fip”或“正向内引物”是指包含用于链引发的序列和与相同的fip引发的链可杂交的序列的正向引物。
42.如本文所使用的术语“bip”或“反向内引物”是指包含用于链引发的序列和与相同的bip引发的链可杂交的序列的反向引物。
43.如本文所使用的术语“正向环引物”或“lpf”是指作为正向引物的环引物。
44.如本文所使用的术语“反向环引物”或“lpb”是指作为反向引物的环引物。
45.优选地，该至少五种引物还包括b3引物。
46.如本文所使用的术语“b3”是指引物对的外部反向引物。
47.本文所描述的特异性结合至靶核酸或其互补序列的dna引物的长度可以是至少10、15或18个核苷酸，b3的长度是至少18、20、22或24个核苷酸，fip和bip的长度是至少25、30、33或36个核苷酸，以及lpf和lpb的长度是至少10、15、17或18个核苷酸。特异性结合至靶核酸序列的dna引物可以具有与对应区域至少80％的互补性的核酸序列，特别是90％的互补性，更特别是95％、96％、97％、98％、99％或100％的互补性。
48.这些术语常用于与环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，lamp)方法相关的方法，如由nagamine et al.2002.molecular and cellular probes 16.223-229所描述的那些。
49.在本发明的方法中，未使用f3引物，因此优选第五种引物为b3引物。这是因为发明人意外地发现，在存在b3引物但不存在f3引物的情况下，检测更快且更灵敏。使用本发明的方法，观察到检测在10分钟内是可能的，并且对检测样本中少量的预定的rna序列更灵敏。换言之，如所附实施例中所示的，使用五种引物，特别是fip、bip、lpf、lpb和b3，在添加引物和酶之后10分钟内实现了支原体属菌株的预定的序列的阳性检测(图1)。因此，本发明的方法第一次提供了使用五种引物的等温扩增系统来检测柔膜菌的污染的可靠且快速的方式。
50.在本发明的方法中，使用了一种或多种提供rna-和/或dna-依赖性dna聚合酶活性与链置换活性的活性的酶。换言之，在rna序列的情况下，所有三种活性都要添加到待分析的rna序列中。在dna序列的情况下，不需要rna-依赖性dna聚合酶的活性。活性可以由一种具有全部两种/三种活性的酶提供，或者由若干种各自具有两种/三种活性中的一种或多种的酶提供。
51.优选地，预定的核酸序列为rna序列或dna序列。
52.此外，优选地，柔膜菌纲的细菌为支原体属的、螺原体属的、无胆甾原体属的或脲原体属的细菌。最优选地，该细菌为支原体属的细菌。
53.进一步优选地，该细菌为口腔支原体、精氨酸支原体、发酵支原体、猪鼻支原体、莱氏衣原体、人型支原体、滑液支原体、柑橘僵化螺原体、肺炎支原体、牛支原体、唾液支原体或鸡毒支原体。
54.在本发明的方法中，如果核酸序列为rna序列，则优选预定的rna序列包含在16s rrna或23s rrna中，特别是上面列出的一种物种的16s rrna或23s rrna中，特别是口腔支原体、精氨酸支原体、发酵支原体、猪鼻支原体、莱氏衣原体、人型支原体、滑液支原体、柑橘僵化螺原体、肺炎支原体、牛支原体、唾液支原体或鸡毒支原体。
55.优选地，本发明的方法中使用的引物是以下中的一些或优选全部：
56.1.fip引物包含tca tcg ttt aca gcg tgg acg aaa gcg tgg gga gca的序列(seq id no:1)；和/或
57.2.bip引物包含gca gct aac gca tta aat agt ttc act ctt gcg agc的序列(seq id no:2)；和/或
58.3.lpf引物包含cta cca ggg tat cta atc的序列(seq id no:3)；和/或
59.4.lpb引物包含tga tcc gcc tga gta gta的序列(seq id no:4)；和/或
60.5.b3引物包含cgg gtc ccc gtc aat tcc的序列(seq id no:5)。上述引物序列靶
agc(seq id no:2)具有至少88％、91％、94％、97％或100％序列同一性的序列，该序列仍然提供引物功能性，
90.c)lpf引物，其包含与序列：cta cca ggg tat cta atc(seq id no:3)具有至少88％、94％或100％序列同一性的序列，该序列仍然提供引物功能性，
91.d)lpb引物，其包含与序列：tga tcc gcc tga gta gta(seq id no:4)具有至少88％、94％或100％序列同一性的序列，该序列仍然提供引物功能性，以及
92.e)b3引物，其包含与序列cgg gtc ccc gtc aat tcc(seq id no:5)具有至少88％、94％或100％同一性的序列，该序列仍然提供引物功能性，
93.优选地，其中，该引物功能性是在seq id no:7处的引物功能性。
94.相对于参考序列的“序列同一性百分比(％)”被定义为，在比对序列并引入间隙(如有必要)以实现最大序列同一性百分比之后，候选序列中与参考序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分比。以确定氨基酸序列同一性百分比为目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公众可用的计算机软件，如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
95.然而，本领域技术人员熟知如何根据样本中待检测的靶序列设计可替代的或另外的引物序列(例如参见jia,b.,et al.,2019,frontiers in microbiology,10,2860)。
96.在本发明的方法中，如果核酸序列为dna序列，则优选预定的dna序列包含在编码柔膜菌纲的细菌的rrna的基因中。
97.如本文所使用的术语“rrna”是指作为核糖体的主要成分的rna。一般而言，存在2种线粒体rrna分子(23s和16s)和4种细胞质rrna(28s、5.8s、5s和18s)。
98.因此，在本发明的方法中，如果核酸序列为dna序列，则优选预定的dna序列包含在编码16s rrna或23s rrna的基因中，特别是上面列出的一种物种的16s rrna或23s rrna，特别是口腔支原体、精氨酸支原体、发酵支原体、猪鼻支原体、莱氏衣原体、人型支原体、滑液支原体、柑橘僵化螺原体、肺炎支原体、牛支原体、唾液支原体或鸡毒支原体。
99.如本文所使用的术语“编码16s rrna的基因”是指来自相关生物体的dna序列，其允许编码16s核糖体rna，并且可以另外包括位于16s核糖体rna基因和23s核糖体rna基因之间的16s核糖体基因间区(intergenic region)。在本发明的某些实施方案中，编码16s rrna的基因为seq id no:7。
100.如本文所使用的术语“编码23s rrna的基因”是指来自相关生物体的dna序列，其允许编码23s核糖体rna。
101.在本发明中，样本可以是任何种类的。然而，优选地，样本获得自原代或修饰的细胞和/或组织、细胞培养物、培养基和/或添加剂、细胞来源的产品、实验室设备或生物制药产物，如前沿疗法药物(atmp)。
102.例如，可以通过遗传操作或培养中传代来修饰细胞，以实现所需的性质。
103.如本文所使用的术语“原代细胞”或“原代培养”是指已经从生物体、器官或组织直接移植的细胞或细胞培养。
104.如本文所使用的术语“细胞培养”是指细胞在多细胞生物体或组织之外的人工体外环境中的维持、生长、繁殖或扩增。通常，细胞培养是在无菌、受控的温度以及大气条件下
在组织培养板(例如，10cm板、96孔板等)或其它贴壁培养(例如，在微载体珠上)中或在悬浮培养(如滚瓶)中实施的。培养物尤其可以在培养皿、摇瓶、小型生物反应器和/或大型生物反应器中生长。生物反应器是一种用于培养细胞的装置，其中可以监测、调节并控制环境条件，如温度、气氛、搅拌和/或ph值。
105.如本文所使用的术语“培养基”是指用于支持细胞的维持、生长、繁殖和/或扩增的固体或液体物质。
106.术语“细胞来源的产物”是指由细胞合成的任何产物或使用由细胞合成的产物在培养容器中产生的产物。细胞来源的产物还包括在细胞成分的帮助下在培养容器中生成的产物，例如，由添加到细胞培养物中的底物通过从细胞产生的/来源的酶而转化的产物。细胞来源的产物包括(但不限于)蛋白质，如生长因子、细胞因子、单克隆抗体、免疫球蛋白产物、酶、激素、融合蛋白、重组蛋白，特别是分泌到细胞培养基中的蛋白质。细胞来源的产物还包括来源于细胞的成分，如细胞膜、细胞壁、细胞器、蛋白质、酶、核酸、核糖体、色素、初级和次级代谢产物。此外，细胞来源的产物还包括细胞提取物或部分(fraction)(含有前述成分的任何组合的混合物)。
107.如本文所使用的术语“生物制药产品”是指从生物技术获得的一种或多种产品，如培养基、细胞培养物、缓冲溶液、人工营养液、血液制品以及血液制品或一种或多种药品的衍生物，或者更普遍地为设计用于医疗领域的产品。此类产品以液体、糊状或粉末的形式存在，在一个或多个相中，是均质的或非均质的。根据刚才给出的定义，本发明也适用于除生物制药产品之外的产品，但是这些产品受到与它们的处理相关的类似要求的约束。
108.术语“前沿疗法药物”或“atmp”是指包含用于治疗目的的细胞材料的生物制药产品。atmp包括但不限于基因疗法药物、体细胞疗法药物和组织工程化药物。
109.原代或修饰的细胞和/或组织、细胞培养物、培养基和/或添加剂、细胞来源的产物、实验室设备、生物制药产品对细菌污染特别敏感，并且柔膜菌纲的细菌是最常见的污染物之一。
110.因此，本发明的方法特别用于测定某些样本中的污染。
111.在本发明的方法中，特别是在其步骤(c)中，温度可以是固定的。
112.如本文所使用的术语“固定温度”是指保持温度条件恒定或几乎恒定，使得酶和引物可以实质上起作用。几乎恒定的温度条件的意思是，不仅设定温度被精确地保持，而且温度的轻微改变在它不破坏酶和引物的实质功能的程度内是可接受的。例如，约从0℃到10℃的温度改变是可接受的。
113.可以通过将温度保持在可以维持待使用的酶的活性的水平来实施在固定温度下的核酸扩增反应。此外，为了在所述核酸扩增反应中实现引物与靶核酸的退火，例如，为了设定反应温度，可以将温度设定在引物的tm值附近或低于该tm值，并且优选通过考虑引物的tm值而将其设定在严格性水平。在所述核酸扩增反应中，扩增反应可以被重复直到酶失活或包括引物的试剂之一用完。
114.换言之，在恒定的温度下在相同的试管中孵育一种或多种酶、dna引物和待分析的样本。该温度优选为50℃至75℃。然而，温度也可以更低，例如30℃至75℃。在可替代的实施方案中，使用降落式(touchdown)温度步骤。换言之，在分析过程中降低温度，例如从70℃的温度开始，然后降低至50℃。
oa.,et al.2010,plos one 5(11):el4155)。
120.通常，由becherer，lisa等人("loop-mediated isothermal amplification(lamp)
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review and classification of methods for sequence-specific detection."analytical methods 12.6(2020):717-746)描述的所有方法都可以与本发明的方法结合。
121.在另一个实施方案中，本发明涉及一种净化被柔膜菌纲的细菌感染的细胞和/或组织培养物的方法，该方法包括：向培养物施用有效量的抗生素，其中，通过使用本发明的方法，培养物先前已被确定为被柔膜菌纲的细菌感染。优选地，抗生素药物为bm cyclin。
122.如本文所使用的术语“有效量”是指足以诱导所需的生物学结果的活性剂(如本文提供的一种或多种化合物单独、组合、或潜在地与其他试剂组合)的量。
123.如本文所使用的术语“抗生素”是指具有可用于抗细菌和/或治疗细菌相关的疾病的性质的试剂、药物或组合物。抗生素尤其可以具有防止、抑制、压制、减少、不利地影响和/或干扰细菌的生长、存活、复制、功能和/或传播的性质。在本发明的上下文中可以使用任何抗生素。然而，一些抗生素是特别有用的，因为柔膜菌纲的细菌不倾向于形成对这些化合物的抗性(vladislav m chernov,et al.,2018,fems microbiology letters,volume 365,issue 18,fny185)。在一些实施方案中，抗生素包括选自由四环素、氟喹诺酮、大环内酯、bm cyclin和去甲酰酶的抑制剂组成的组中的至少一种。
124.术语“bm cyclin”是指用于从感染的细胞培养物中消除支原体而没有明显的显著细胞毒性副作用的组合物。bm cyclin通常包括泰妙菌素(tiamulin)和米诺环素(minocyclin)。
125.本发明的方法能够有效地确定柔膜菌纲的细菌，并且有助于早期检测、筛选、监测。因此，本发明的方法改进了抗生素的特定用途，例如，在净化过程中。
126.为了实施本发明的方法，可以通过收集必要的试剂来制备试剂盒。在另一个实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，特别是用于检测样品中的核酸分子的试剂盒，特别是用于检测样品中的柔膜菌纲的细菌的污染的试剂盒。试剂盒包含一种或多种、优选全部五种或六种引物，用于检测柔膜菌纲的细菌的预定的序列。试剂盒还可以包含多于一个的引物系统，特别是两个或更多个靶向柔膜菌纲的相同细菌或不同细菌的不同序列的引物系统。因此，本发明的方法和本发明的试剂盒可以用于通过使用多于一种的引物系统来检测样本中的多于一种的柔膜菌纲的不同细菌，例如，通过使用含有淬灭剂-荧光团双链区的引物(tanner na,zhang y,evans tc jr.simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification.biotechniques.2012；53(2):81-89.)。在这方面，令人意外地发现，由于减少的引物干扰，减少的引物数量导致多于一种引物系统的可用性提高。
127.在本发明的特别优选的实施方案中，本发明的(在上下文中待制备的)试剂盒或本发明的方法和用途还可以包括或提供有使用手册(instruction manual)。例如，所述使用手册可以指导技术人员(如何)在本文提供的诊断用途中和根据本发明使用本发明的试剂盒。特别地，所述使用手册可以包括使用或应用本文提供的方法或用途的指南。
128.除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管类似于或相当于本文所描述的方法和材料的那些可以用于本发明的实践或测试中，但是下文描述了合适的方法和材料。如果存在冲
突，将以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅为说明性的，而并非旨在限制。
129.除非另有说明，否则可以根据本领域众所周知的常规方法以及在遍及本说明书中引用的和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所描述的方法来实施本文所描述的一般方法和技术。例如，参见sambrook et al.,molecular cloning:a laboratory manual,2d ed.,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.(1989)和ausubel et al.,current protocols in molecular biology,greene publishing associates(1992),以及harlow and lane antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.(1990)。
130.虽然在附图和前文的描述中详细说明并描述了本发明的方面，但是这种说明和描述被认为是说明性或示例性的，而不是限制性的。可以理解的是，在以下权利要求的范围和精神内，本领域技术人员可以进行改变和修改。特别地，本发明涵盖了具有来自上文和下文描述的不同实施方案的特征的任何组合的其它实施方案。
131.图1示出了用于检测柔膜菌纲的细菌的五引物和六引物系统的比较。
132.此外，在权利要求书中，词语“包括/包含(comprising)”不排除其它元素或步骤，而不定冠词“一个(a)”或“一种(an)”不排除多个。单个单元可以实现权利要求中列举的若干特征的功能。特别地，与属性或值相关的术语“本质上”、“约”、“近似”等也分别准确地定义了属性或值。权利要求中的任何附图标记都不应被解释为对范围的限制。
实施例
133.以下是本发明的方法和组合物的实施例。可以理解的是，考虑到上面提供的一般描述，可以实施各种其它实施例。
134.不具有f3的新的5引物系统与具有f3的6引物系统一样有效地扩增柔膜菌
135.表1-引物
[0136][0137]
表2-引物混合物:新的5引物系统
[0138] 终浓度fip1.6μmbip1.6μmlpf0.8μmlpb0.8μmb30.4μm
[0139]
表3-引物混合物:lamp 6引物系统
[0140] 终浓度
fip1.6μmbip1.6μmlpf0.8μmlpb0.8μmb30.2μmf30.2μm
[0141]
表4-引物/酶混合物(pem)
[0142] vol/rx等温反应混合物(master mix)15.0μl引物混合物2.0μl 17.0μl
[0143]
每次反应添加17.0μl的pem
[0144]
模板添加
[0145]
添加8.0μl提取的rna
[0146]
添加8.0μl作为阴性分析对照的无核糖核酸酶(rnase)的h2o
[0147]
表5-用于等温扩增与染料采集的设置
[0148]